PEMBAHASAN DAN KESIMPULAN LAPORAN BIOKIMIA: ISOLASI DNA

PEMBAHASAN ISOLASI DNA

Pada praktikum kali ini yang kami lakukan adalah mengisolasi  DNA dari sampel yang berupa daging sapi. Isolasi DNA sendiri merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA murni, yakni DNA saja tanpa protein dan tanpa RNA dari suatu sel dalam jaringan.

Ketika kita ingin mengisolasi DNA, penting sekali untuk kita ketahui dimana sebenarnya posisi DNA itu. Seperti yang kita ketahui ya, suatu organ itu tersusun atas jaringan-jaringan, dimana jaringan itu sendiri terdiri atas gabungan sel yang sangat banyak. Setiap sel, tersusun atas organel-organel sel. Ada mitokondria, ada ribosom, ada nukleus, ada badan golgi. Nah, DNA ini terletak dalam nukleus bersama dengan RNA dan protein-protein. Berikut gambarannya:

Dengan begitu akan mudah dipahami bagaimana maksud dan tujuan dari setiap langkah kerja yang akan dilakukan . Dari gambaran tersebut, dapat kita ketahui, hal yang pertama tama harus dilakukan adalah memecah jaringan menjadi sel-sel yang mandiri. Sel-sel tersebut kemudian dipecah dinding selnya, begitupula dengan membran nukleus agar DNA dapat keluar. Ada 3 prinsip utama dalam proses isolasi DNA yakni:

1.      Lisis/Penghancuran

2.      Ekstraksi

3.      Dan pemurnian DNA

Berikut pembahasan proses dan hasil dari praktikum yang kami lakukan:

1.      Daging + Buffer Ekstraksi

Proses isolasi DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA, yang bertujuan untuk memisahkan DNA dengan partikel lain yang tidak diinginkan. Proses ini harus dilakukan dengan hati-hati agar tidak menyebabkan kerusakan pada DNA. Untuk mengeluarkan DNA dari sel, dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik dengan cara mekanik maupun kimiawi.

Secara kimiawi dapat dilakukan dengan pemberian bahan-bahan yang dapat merusak membran sel dan membran inti. Disini kami menggunakan cara kimiawi, yakni dengan penambahan buffer ekstraksi. Buffer ekstraksi merupakan campuran dari Tris+EDTA+CTAB (Cetyl trymethyl ammonium chlorid) serta NaCl.

·         Tris

 Berperan sebagai buffer untuk menjaga pH DNA agar berada dalam kondisi yang optimum.

·         EDTA

Berperan sebagai agen pengelat yang dapat mengikat ion-ion logam seperti Ca⁺ dan Mg⁺ yang menyusun membran sel, sehingga komponen-komponen membran terluar sel akan terurai.

·         CTAB

Berperan untuk memisahkan polisakarida dari dinding sel.

·         NaCl

Berperan dalam proses ekstraksi.

2.      Campuran + Buffer Lisis 1

Sel-sel yang telah diekstrak dapat dengan mudah diresuspensikan di medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan SDS (Sodium Dodesil Sulfat) yang merupakan isi dari buffer lisis. Buffer lisis 1 ini berfungsi untuk memecah dinding/membran dari sel-sel. Dinding sel dan membran sel lapisan pembungkus DNA tersusun atas lipid/lemak. Untuk itu diperlukan detergen atau garam agar dapat melisiskan/menghancurkan lemak penyusun dinding sel tersebut.

3.      Campuran + Enzim Proteinase K

Fungsi dari penambahan enzim proteinase K ini adalah untuk membantu melisiskan secara ezimatik dengan cara memutus ikatan peptida dalam komponen sel. Lalu divortex agar pemutusan ikatan-ikatan peptida terjadi lebih cepat serta untuk menghomogenkan. Selain divortex, selanjutnya diinkubasi dalam penangas air. Kemarin karena suhu yang kami gunakan adalah 65°C maka waktu yang diperlukan adalah hanya 15 menit. Jika suhu yang digunakan adalah 55°C maka waktunya menjadi 30 menit,. Tujuan dilakukannya inkubasi adalah untuk mengoptimalkan kerja enzim, yang mana kita tahu sendiri bahwa enzim merupakan protein yang sifatnya sangat dipengaruhi oleh temperatur dan agar proses lisinya berjalan sempurna.

4.      Campuran + Buffer Lisis 2

Dinding sel yang telah pecah/lisis pada tahap sebelumnya menyebabkan organel-organel sel dapat keluar, sehingga dalam larutan tidak hanya ada DNA namun juga RNA, protein. Sehingga DNA perlu dibersihkan dari pengotor, penambahan buffer lisis 2 disini yang berisi garam K-Asetat yang berperan sebagai garam dengan konsentrasi tinggi, garam ini menyebabkan single strand RNA tidak bisa larut dalam keadaan tersebut.

Dilanjutkan dengan proses sentrifugasi. Prinsip dasar dari proses sentrifugasi ini adalah memisahkan molekul berdasarkan ukuran dan berat molekul. Sampel yang disentrifugasi dengan kecepatan tinggi menyebabkan komponen-komponen yang ukuran dan berat molekulnya besar mengendap pada dasar tabung yang disebut dengan pellet.  Sehingga pada akhirnya akan terbentuk 2 fase. Dan bagian atasnya, berupa cairan bening yang biasa disebut supernatan. Disini kecepatan sentrifugasi yang kami lakukan adalah 14.000 rpm (rotasi per menit) selama 5 menit. Nah, DNA yang diisolasi berada pada fase atas, sehingga lapisan inilah yang selanjutnya diambil, sedangkan lapisan bawahnya dibuang.

5.      Campuran + Kloroform

Protein yang mungkin ikut terbawa dalam fase atas, dipresipitasi dengan pelarut organik, salah satunya adalah kloroform. Dan kembali disentrifugasi. Hasil akhirnya terbentuk 3 fase, yakni fase atas yang terdapat DNA di dalamnya, lalu ada fase tengah berupa gumpalan protein, dan fase bawah berupa kloroform. Nah yang diambil adalah fase atasnya lagi.

6.      Campuran + Etanol 100%

Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan Alkohol 100%. Dalam alkohol, DNA akan terpresipitasi (menggumpal). Sebelum-sebelumnya, karena posisi DNA itu terlarut dalam air, tidak terdapat gumpalan DNA, karena DNA nya sendiri larut dalam air. Seharusnya pada tahap ini benang-benang gumpalan DNA dapat terlihat, tetapi ternyata tidak terlihat. Untuk itu kami letakkan dulu dalam lemari es dengan suhu -21C untuk membantu presipitasi DNA. Setelah ditunggu beberapa saat, benang-benang DNA dapat terlihat.

            Selanjutnya untuk mengetahui apakah DNA yang diperoleh murni atau tidak, dan untuk mengetahui apakah DNA hasil isolasi tercemar dengan RNA atau tercemar protein maka perlu dilakukan uji kemurnian DNA. Pengujian dilakukan dengan mengukur absorbansi DNA hasil isolasi pada 2 panjang gelombang yang berbeda. Yakni pada  l 260 dan l 280. Kenapa harus diukur pada panjang gelombang tersebut? Karena pada l 260 nm kita dapat mengetahui kadar DNA dan RNA. Sedangkan kadar protein dapat diketahui kadarnya pada l 280 nm. Nah, data absorbansi yang diperoleh dari hasil pengukuran tersebut, dibandingkan. Didapat rasio antara l 260 dengan l 280. DNA dapat dikatakan murnin jika rasionya berada pada rentang 1,6 – 2,0.

            Jika rasio yang didapat <1,6 maka DNA tidak murni karena ada cemaran/kontaminasi protein, fenol dan senyawa organik lainnya. Dan jika rasio nya itu >2,0 maka DNA terkontaminasi RNA, sehingga hasil yang didapat tidak benar-benar DNA saja/tidak murni. Rasio hasil percobaan kami nilainya <1,6 yakni hanya sebesar 0,232. Hal ini terjadi karena banyak sekali kemungkinan, diantaranya karena proses yang dilakukan terlalu banyak kemungkinan terjadinya kesalah pun  akan semakin besar, entah pada proses sentrifugasinya, pada saat penambahan bahan-bahan, ataupun saat pengambilan fase DNA, mungkin karena kurang hati-hati zat-zat lain juga ikut terambil.

KESIMPULAN

1)      Isolasi DNA berhasil dilakukan.

2)      Karena rasio yang diperoleh adalah 0,232 maka dapat disimpulkan DNA terkontaminasi oleh protein, fenol, dan senyawa organik lainnya.

3)      Jumlah DNA hasil isolasi adalah 81úg/ml