PEMBAHASAN DAN KESIMPULAN LAPORAN BIOKIMIA: ISOLASI DNA
PEMBAHASAN ISOLASI DNA
Pada praktikum kali ini yang kami lakukan
adalah mengisolasi DNA dari sampel yang berupa daging sapi. Isolasi DNA sendiri
merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA murni, yakni DNA saja tanpa
protein dan tanpa RNA dari suatu sel dalam jaringan.
Ketika kita ingin mengisolasi DNA, penting sekali
untuk kita ketahui dimana sebenarnya posisi DNA itu. Seperti yang kita ketahui
ya, suatu organ itu tersusun atas jaringan-jaringan, dimana jaringan itu
sendiri terdiri atas gabungan sel yang sangat banyak. Setiap sel, tersusun atas
organel-organel sel. Ada mitokondria, ada ribosom, ada nukleus, ada badan
golgi. Nah, DNA ini terletak dalam nukleus bersama dengan RNA dan
protein-protein. Berikut gambarannya:
Dengan begitu akan mudah dipahami bagaimana maksud
dan tujuan dari setiap langkah kerja yang akan dilakukan . Dari gambaran
tersebut, dapat kita ketahui, hal yang pertama tama harus dilakukan adalah memecah
jaringan menjadi sel-sel yang mandiri. Sel-sel tersebut kemudian dipecah dinding selnya, begitupula dengan membran nukleus agar DNA dapat keluar. Ada 3 prinsip utama dalam proses isolasi
DNA yakni:
1. Lisis/Penghancuran
2. Ekstraksi
3. Dan pemurnian DNA
Berikut
pembahasan proses dan hasil dari praktikum yang kami lakukan:
1.
Daging + Buffer Ekstraksi
Proses isolasi DNA diawali dengan proses ekstraksi
DNA, yang bertujuan untuk memisahkan DNA dengan partikel lain yang tidak
diinginkan. Proses ini harus dilakukan dengan hati-hati agar tidak menyebabkan
kerusakan pada DNA. Untuk mengeluarkan DNA dari sel, dapat dilakukan dengan
memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik dengan cara
mekanik maupun kimiawi.
Secara kimiawi dapat dilakukan dengan pemberian
bahan-bahan yang dapat merusak membran sel dan membran inti. Disini kami
menggunakan cara kimiawi, yakni dengan penambahan buffer ekstraksi. Buffer
ekstraksi merupakan campuran dari Tris+EDTA+CTAB (Cetyl trymethyl ammonium
chlorid) serta NaCl.
·
Tris
Berperan sebagai buffer untuk menjaga pH DNA
agar berada dalam kondisi yang optimum.
·
EDTA
Berperan sebagai agen
pengelat yang dapat mengikat ion-ion logam seperti Ca+ dan Mg+
yang menyusun membran sel, sehingga komponen-komponen membran terluar sel akan
terurai.
·
CTAB
Berperan untuk
memisahkan polisakarida dari dinding sel.
·
NaCl
Berperan dalam proses
ekstraksi.
2.
Campuran + Buffer Lisis 1
Sel-sel yang telah diekstrak dapat dengan mudah diresuspensikan
di medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu
diperlakukan dengan SDS (Sodium Dodesil Sulfat) yang merupakan isi dari buffer
lisis. Buffer lisis 1 ini berfungsi untuk memecah dinding/membran dari sel-sel.
Dinding sel dan membran sel lapisan pembungkus DNA tersusun atas lipid/lemak.
Untuk itu diperlukan detergen atau garam agar dapat melisiskan/menghancurkan
lemak penyusun dinding sel tersebut.
3.
Campuran + Enzim Proteinase K
Fungsi dari penambahan enzim proteinase K ini adalah
untuk membantu melisiskan secara ezimatik dengan cara memutus ikatan peptida
dalam komponen sel. Lalu divortex agar pemutusan ikatan-ikatan peptida terjadi
lebih cepat serta untuk menghomogenkan. Selain divortex, selanjutnya diinkubasi
dalam penangas air. Kemarin karena suhu yang kami gunakan adalah 65°C maka
waktu yang diperlukan adalah hanya 15 menit. Jika suhu yang digunakan adalah 55°C
maka waktunya menjadi 30 menit,. Tujuan dilakukannya inkubasi adalah untuk
mengoptimalkan kerja enzim, yang mana kita tahu sendiri bahwa enzim merupakan
protein yang sifatnya sangat dipengaruhi oleh temperatur dan agar proses
lisinya berjalan sempurna.
4.
Campuran + Buffer Lisis 2
Dinding sel yang telah pecah/lisis pada tahap
sebelumnya menyebabkan organel-organel sel dapat keluar, sehingga dalam larutan
tidak hanya ada DNA namun juga RNA, protein. Sehingga DNA perlu dibersihkan
dari pengotor, penambahan buffer lisis 2 disini yang berisi garam K-Asetat yang
berperan sebagai garam dengan konsentrasi tinggi, garam ini menyebabkan single
strand RNA tidak bisa larut dalam keadaan tersebut.
Dilanjutkan dengan proses sentrifugasi. Prinsip
dasar dari proses sentrifugasi ini adalah memisahkan molekul berdasarkan ukuran
dan berat molekul. Sampel yang disentrifugasi dengan kecepatan tinggi
menyebabkan komponen-komponen yang ukuran dan berat molekulnya besar mengendap
pada dasar tabung yang disebut dengan pellet. Sehingga pada akhirnya akan terbentuk 2 fase. Dan
bagian atasnya, berupa cairan bening yang biasa disebut supernatan. Disini
kecepatan sentrifugasi yang kami lakukan adalah 14.000 rpm (rotasi per menit)
selama 5 menit. Nah, DNA yang diisolasi berada pada fase atas, sehingga lapisan
inilah yang selanjutnya diambil, sedangkan lapisan bawahnya dibuang.
5.
Campuran + Kloroform
Protein yang mungkin ikut terbawa dalam fase atas,
dipresipitasi dengan pelarut organik, salah satunya adalah kloroform. Dan
kembali disentrifugasi. Hasil akhirnya terbentuk 3 fase, yakni fase atas yang
terdapat DNA di dalamnya, lalu ada fase tengah berupa gumpalan protein, dan
fase bawah berupa kloroform. Nah yang diambil adalah fase atasnya lagi.
6.
Campuran + Etanol 100%
Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian
dimurnikan dengan Alkohol 100%. Dalam alkohol, DNA akan terpresipitasi
(menggumpal). Sebelum-sebelumnya, karena posisi DNA itu terlarut dalam air,
tidak terdapat gumpalan DNA, karena DNA nya sendiri larut dalam air. Seharusnya
pada tahap ini benang-benang gumpalan DNA dapat terlihat, tetapi ternyata tidak
terlihat. Untuk itu kami letakkan dulu dalam lemari es dengan suhu -21C untuk
membantu presipitasi DNA. Setelah ditunggu beberapa saat, benang-benang DNA
dapat terlihat.
Selanjutnya untuk mengetahui apakah
DNA yang diperoleh murni atau tidak, dan untuk mengetahui apakah DNA hasil
isolasi tercemar dengan RNA atau tercemar protein maka perlu dilakukan uji
kemurnian DNA. Pengujian dilakukan dengan mengukur absorbansi DNA hasil isolasi
pada 2 panjang gelombang yang berbeda. Yakni pada l
260 dan l
280. Kenapa harus diukur pada panjang gelombang tersebut? Karena pada l 260 nm kita dapat
mengetahui kadar DNA dan RNA. Sedangkan kadar protein dapat diketahui kadarnya
pada l
280 nm. Nah, data absorbansi yang diperoleh dari hasil pengukuran tersebut,
dibandingkan. Didapat rasio antara l
260 dengan l
280. DNA dapat dikatakan murnin jika rasionya berada pada rentang 1,6 – 2,0.
Jika rasio yang didapat <1,6 maka DNA tidak murni
karena ada cemaran/kontaminasi protein, fenol dan senyawa organik lainnya. Dan
jika rasio nya itu >2,0 maka DNA terkontaminasi RNA, sehingga hasil yang
didapat tidak benar-benar DNA saja/tidak murni. Rasio hasil percobaan kami
nilainya <1,6 yakni hanya sebesar 0,232. Hal ini terjadi karena banyak
sekali kemungkinan, diantaranya karena proses yang dilakukan terlalu banyak
kemungkinan terjadinya kesalah pun akan
semakin besar, entah pada proses sentrifugasinya, pada saat penambahan
bahan-bahan, ataupun saat pengambilan fase DNA, mungkin karena kurang hati-hati
zat-zat lain juga ikut terambil.
KESIMPULAN
1)
Isolasi DNA
berhasil dilakukan.
2)
Karena rasio
yang diperoleh adalah 0,232 maka dapat disimpulkan DNA terkontaminasi oleh
protein, fenol, dan senyawa organik lainnya.
3)
Jumlah DNA hasil
isolasi adalah 81úg/ml
Komentar